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      实验操作视频

      实验视频操作

       实验步骤:1
      1. 样品准备
      裂解液(RIPA)准备-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原钒酸钠溶液,现配现用。加入PMSF,加入原钒酸钠溶液。
      组织样本-----黄豆大小组织剪碎,加入200-300 ul配备好的裂解液,冰上研磨,12000转离心5 min,取上清。
      贴壁细胞-----6孔板一个孔长满,加150 ul配备好的裂解液,冰上裂解5-10 min,枪头吹打,吸取裂解好的样本,转入EP管,12000转离心5 min,取上清。
      悬浮细胞-----细胞转入离心管,2000转离心5 min,弃上清,加入PBS清洗,2000转离心5 min,弃上清,每20 ul体系细胞加入150 ul裂解液,冰上裂解5-10 min,枪头吹打充分裂解,12000转离心5 min,取上清。

      2. 蛋白浓度测定
      标准曲线制备
      待检样本上样
      加入显色剂,室温避光20-30 min
      酶标仪测定OD值
      计算蛋白上样量(建议每样本上样总蛋白含量为50 μg)

      3. 样本变性
      每40 μL蛋白,加10 ul的5XSDS 上样缓冲液
      沸水浴10 min
      -20℃保存

      4. SDS-PAGE胶制备
      灌入分离胶
      无水乙醇压平
      分离胶完全聚合后,倒出无水乙醇
      双蒸水冲洗
      滤纸吸干
      加入浓缩胶
      插上梳齿
      浓缩胶完全聚合后取出梳齿

      5. 电泳
      胶固定到电泳槽
      倒入电泳液
      加样,加marker,
      电泳----80 V恒压至溴酚蓝到浓缩胶与分离胶交界处,改110 V恒压至溴酚蓝到凝胶底部

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